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PCR仪厂家解疑使用过程中的常见现象原因
点击次数:111 发布时间:2018-10-13
 

1、产生非特异性条带

   用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带,则需要用DNaseI重新处理样品。

   在PCR反应中,非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm2至5℃的温度下进行退火,降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。

   由于mRNA剪切方式的不同,根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

2、产生弥散(smear)条带

   在PCR反应体系中第一链产物的含量过高;减少引物的用量;优化PCR反应条件/减少PCR的循环次数

   在用DNase处理被DNA污染的RNA样品时,其产生的寡核苷酸片段会产生非特异性扩增,一般会显示为弥散背景。

3、产生大分子量的弥散条带

   大多数情况下是由于退火温度过低而导致的非特异性的起始及延伸产生的。对于长片段的PCR,建议将反应体系中cDNA的浓度稀释至1:10(或1:100-1:200)

4、在无反转录酶的情况下,对照RNA获得扩增结果

   通常是由于对照RNA中含有痕量DNA而导致的。由于进行体外转录时不可能将所有的DNA模板消除。建议可将第一链cDNA稀释1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影响。有可能是引物二聚体的条带。

5、扩增产物滞留在加样孔中

   有可能是由于模板量过高而导致PCR结果产生了高分子量的DNA胶状物。建议将第一链结果至少稀释100倍再进行二次扩增。另外,在二次PCR时使用的退火温度如果比引物的Tm值低5℃,可以将退火温度适当增高或进行热启动以提高特异性。

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